Лактоферрин. Бактерии.

Пошкодження зовнішньої мембрани ентеральних грам-негативних
бактерій лактоферріном і трансферріном
РІЧАРД Т. ЕЛІСІН III, * Теодора Дж. Гіхла, Ф. МАРК ЛАФРЕКТ,
Медичний центр, медичний центр адміністрації ветеранів та відділ інфекційних
хвороб, кафедра медицини, Університет Колорадо Школа Медицини, Денвер,
Колорадо 80220
Отримано 10 березня 1988 р./Прийнято 26 липня 1988 р.
Багато досліджень показали, що лактоферрин і трансферрин мають
антимікробну активність проти грамнегативних бактерій, але механізм дії не
визначено. Ми висунули гіпотезу, що білки, що зв'язують залізо, можуть
впливати на грамнегативну зовнішню мембрану способом, подібним до схеми
ЕДТА хелатора. Перевірено здатність лактоферрина та трансферину
вивільняти радіоактивно помічений ліпополісахарид (LPS) з мутанта
Escherichia coli з дефіцитом UDP-галактози з епімеразою та штамів Salmonella
typhimurium дикого типу. Початкові дослідження в барбітально-ацетатному
буфері показали, що ЕДТА та лактоферрин викликають значне вивільнення LPS
з усіх трьох штамів. Подальші дослідження виявили, що виділення LPS було
заблоковано насиченням лактоферрина заліза, це відбувалося між рН 6 та 7,5, і
було порівняно з концентрацією бактерій від 104 до 107 КОУ / м.і. та
збільшувалося з збільшенням концентрації лактоферрина. Дослідження з
використанням збалансованої солі Hanks, що не містить кальцію та магнію,
показало, що трансферрин також може викликати вивільнення LPS. Крім того,
як лактоферрин, так і трансферрин збільшували антибактеріальний ефект
суінгібіторної концентрації рифампіпіну, препарату, виключеного зовнішньою
бактерією. Ця робота показує, що ці залізо-зв'язуючі білки пошкоджують
грамнегативну зовнішню мембрану та змінюють проникність бактеріальної
зовнішньої мембрани.
Імунний захист організму на поверхні слизової оболонки, слабо характеризується,
хоча більшість бактеріальних інфекцій розвивається через поширення
захворювання з цих ділянок. Секреція слизової оболонки має антибактеріальний
арсенал, і дуже сильно відрізняється від сироватки (28, 41). Хоча існує порівняно
невеликий імуноглобулін G (IgG) і IgM, існують і високі концентрації секреторного
IgA (sIgA), лізоциму та білка лактоферніну, що зв'язує залізо. Лактоферрін
виявляється при низьких рівнях у сироватці крові, але вимірюється при
концентраціях до 9-14 мг / мл у секретах слизової оболонки (28, 29, 41, 50, 51). З
подальшого інтересу цей білок також присутній при високих концентраціях в межах
специфічних гранул поліморфноядерних лейкоцитів (30, 41, 51). Як in vivo, так і in
vitro дослідження показують, що лактоферрин має антибактеріальну активність
(12). Велика кількість незалежних дослідників виявили, що лактоферрин має
бактеріостатичний ефект на різноманітний спектр грамнегативних бактерій, і цей
ефект блокується, якщо протеїн насичений залізом (7, 15, 21, 35, 41 , 42, 46, 48).
Основною гіпотезою, яка висувається для цієї діяльності, є те, що лактоферрин
виробляє залізодефіцитне середовище, яке обмежує бактеріальний ріст. Кілька
рядків свідчать про те, що лактоферрин може впливати на грамнегативні бактерії на
додаток до тих, що є результатом позбавлення їжі заліза. По-перше, декілька
дослідників встановили, що антимікробна активність лактоферрина проти бактерій
посилюється при експоненційному впливі організмів на IgG або sIgA (9, 39, 45- 47).
Було висловлено припущення, що ця взаємодія розвивається тому, що антитіла,
спрямовані проти бактеріальних сидерофорів, пригнічують метаболізм
бактеріального заліза більше, ніж тільки лактоферрин. Однак ця гіпотеза ще не
підтверджена, а точне пояснення комбінованого ефекту не було запропоновано (17).
По-друге, хоча це суперечливо, робота Арнольда та партнерів показала, що
лактоферрин має безпосередню бактеріоцидну активність проти декількох бактерій,
у тому числі штамів Escherichia coli, Vibrio cholerae, Streptococcus mutans,
Streptococcus pnelimoniae та Legionella pneumophila (2- 5, 10). Як і в бактеріостазі,
виробленому лактоферріном, цей ефект гальмується насиченням заліза білка. Ефект
не відтворюється шляхом впливу бактерій на оточуюче залозине середовище (5).
Крім того, активність проти L. pneumophila інгібується додаванням магнію (10).
Дослідження імунофлюоресценції показали, що лактоферин, як видається, є
асоційованою клітиною (3); на цій підставі ці дослідники постулювали, що
дестабілізація мембран може сприяти бактерицидному впливу лактоферрина (10).
Що стосується лактоферрина, то кілька досліджень показали, що сироватковий
залізо-зв'язуючий білок трансферин також має антибактеріальну активність (12,
14). Антитіла і комплементзалежна бактерицидна активність сироватки проти E.
coli, Neisseria gonorrhoeae та Pasteurella septica можуть бути заблоковані насиченням
сироваткової заліза (13, 20, 36). Оскільки ці аналізи виконуються у присутності
свіжої сироватки, яка містить частково насичений трансферрин, це свідчить про те,
що цей протеїн сприяє знищенню сироваткою грамнегативних бактерій. Крім того,
подібно до деяких невідповідностей, що спостерігаються при лактоферрині,
механізм, за допомогою якого депривація заліза може змінити ефективність
опосередкованої антибактеріальною активністю, не визначена. В іншому полі
дослідники, що вивчають структуру грамнегативних бактерій, показали, що
синтетичні хелатори металів мають значну антибактеріальну активність проти
гранично-негативних бактерій (26, 34). ЕДТА виділяє до 50% ліпополісахариду (LPS)
з зовнішньої мембрани бактерій, підвищує проникність мембрани до гідрофобних
молекул і чутливість бактерій до ефектів комплементу та лізоциму (34). Ці та інші
дослідження сприяли моделі грам негативної зовнішньої мембрани як
асиметричного ліпідного бішару з великими молекулами LPS, обмеженими
зовнішнього шару та неполярних фосфоліпідів на внутрішній мембрані. Хоча
гідрофобні взаємодії LPS-LPS або LPS-протеїну сприяють підтримці цілісності
зовнішнього шару, наявність двовалентних катіонів у мембрані, як видається, є
критичною для стабілізації несприятливих негараздів кореолігосахаридного
ланцюга молекул LPS (16). Зв'язуючи ці сполуки, пов'язані з мембранами, ЕДТА
виділяє молекули ЛПС з зовнішнього шару. Крім того, якщо виділений LPS замінено
неполярними фосфоліпідними речовинами з внутрішнього шару, мембрана стає
більш прохідною для гідрофобних агентів (таких як рифампіпін), які зазвичай
виключаються гідрофільним бар'єром LPS (26, 34). Показано, що білки трансферину
з різних порід зв'язують широкий спектр іонів металів крім заліза, у тому числі міді,
хрому, кобальту, кадмію, мангану, нікелю, індію, галію, алюмінію, скандії та цинку
(14) . Незважаючи на те, що спектр зв'язування металів не був повністю
охарактеризований для лактоферрина та трансферину людини, ми висунули
гіпотезу, що ці білки можуть бути широко активними як хелатори і можуть мати
вплив на грам негативну зовнішню мембрану, подібну до ЕДТА. Ми повідомляємо
про те, що лактоферрин, способом, подібним до синтезу цього синтезу, викликає
вивільнення LPS з ентеральних грамнегативних бактерій і що обидва білки, що
зв'язують залізо, змінюють проникність грамнегативної зовнішньої мембрани.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Лактоферрин, трансферрин та антисептидні препарати. Людський лактоферрин,
очищений від молока, був куплений комерційно (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. або
Calbiochem-Behring, La Jolla, Calif.), Як і людський трансферрин очищений від
сироватки (Sigma). Наступні антисепідні препарати були куплені комерційним
способом і використовувались для перевірки чистоти лактоферрина: антитіла
лактоферрину кролика (Organon Teknika, Malvern, Pa.), антитіла трансферрину
кролика (Organon Teknika), козячі антитіла трансферрину (Kallestad Laborato- ries,
Inc., Austin, Tex.).
Вимірювання білка.
Концентрації білків визначали методом біурету Мокраша та МакГільвери (33).
Вимірювання заліза.
Рівень заліза в окремих зразках вимірювали за допомогою безплампеневої атомної
абсорбації (спектрометр Perkin-Elmer 5000 [Норвалк, штат Коннектикут], оснащений
500 прогремнером та автоматичним пробником AS-1) у лабораторії Аллен Алфрі
(Адміністратор ветеранів - Ізрація Медичний центр, Денвер, штат Колорадо).
Подвійна імунодіффузія.
Подвійну імунодіффузію проводили при кімнатній температурі протягом 18 годин у
0,6% агарозі в фосфатно-буферному фізіологічному розчині, рН 7,0.
SDS-PAGE лактоферрину.
Розривний ефект додецилсульфатно-поліакриламідного
гель-електрофорезу (SDS-PAGE) лактоферрина проводився в модифікованій гель
Laemmli-гелі з 1,5-міліметровими гелевими плитами з гелевими розшаруваннями
4,5% і 10% (8, 25). SDS-PAGE гелі проаналізували шляхом модифікованого
відтворення срібла або західного блотінгу (імуноблоттингу) методами Oakley et al. і
Towbin et al., відповідно (37, 54). Сироватка антитіл лактоферріна була розбавлена у
пропорції 1: 500, а інші сироватки розведені як 1:100. Пероксидат хріну,
кон'югований з білком Staphylococcus aureus A (Amersam International plc, Amersham,
Об'єднане Королівство), використовували при розведенні 1: 2000 для ідентифікації
пов'язаних антитіл.
Приготування насиченого та аполактоферрину та трансферіну.
Розчини
апопротеїнів були одержані методом Мазур'є та Спіка (31), а насичені препарати
проводили за методом Захід і Спарлінг (59).
Ріст бактерій.
Мутантний UDP-галактозний епімеразний дефіцит штаму E. coli (CL99-2) був
отриманий від Кіта А. Столяр (National Institutes of Health, Bethesda, Md.). Це гладкий
сироватковий стійкий штам, який виробляє галактозу, що містить LPS, у визначених
підрозділах О-полісахаридів. Проте вона нездатна виготовляти галактозу і, якщо не
забезпечена екзогенною галактозою, не може виробляти повну молекулу ЛПС (24).
Коли штам вирощується в присутності [3H] галактози, радіоактивна марка майже
виключно включається в О-полісахарид LPS (19). Мутантний штам не
інкапсульований, і було показано, що у його зовнішній мембрані більше ЛПС, ніж у
батьківському штамі (18).
Для досліджень штам був вирощений в розчині WMS з невеликими змінами (52).
Середній був приготований як розчин 0,12 М Tris, 0,02 М КСІ, 0,02 М NH4Cl, 3мМ
Na2SO4, 1мМ MgCl2, 2х10-4М CaCl2, 2х10-6М ZnCl2, 2х10-3М K2HPO4 додавали 0,5%
глутамату, 1,0 г казамінових кислот (Difco Laboratoires, Detroit, Mich.) На літр і 0,25%
гліцерину з або без 0,03 мМ галактози в якості джерел вуглецю.
Два диких типи гладких штаммів Salmonella typhimurium, SL696 та SH4247, які також
включають великий відсоток екзогенної галактози в LPS, були отримані від Ілкки М.
Хеландер (Національний інститут громадського здоров'я Хельсінкі, Фінляндія) (23,
27, 61). Ці штами спочатку вирощували в бурі Лурія з додаванням 2 мМ CaCl до того,
як вони були перевірені на чутливість до лактоферрину або трансмірін-
опосередкованого вивільнення LPS (23).
Аналіз вивільнення LPS. Штам, що піддають випробуванню в аналізі вивільнення LPS, вирощували до
стаціонарної фази у визначеному галактозо-дефіцитному середовищі
(модифікований бульйон WMS), і частину потім додавали до 1мл розчину WMS,
доповненого 0,03мМ неегольованої галактози та 4-15см D- [6-3H] галактози (24, 52).
Клітини вирощували протягом 4 год (фаза середньої логовості) при 37 ° С,
центрифугували, промивали та розводили до відповідної концентрації КФК на
мілілітр. Спочатку були підготовлені дублікати 1,0-мл аналіз вивільнення, що
включали бактерії, мічені галактозою [3H], бурбітат-ацетатний буфер та різні
концентрації досліджуваних матеріалів у поліпропіленових пробірках. Подальша
робота проводилася з загальним об'ємом 0,5 мл. Після додавання бактерій для
завершення аналізованої суміші 0 мін зразки негайно перемішували і
центрифугували, а супернатант і гранули обліпили протягом 5 хвилин в бета-
лічильнику з відповідними корекціями для фонового відліку. 30-хвилинні аналізи
інкубували при 37 ° С, а потім аналогічним чином перемішували, центрифугували та
підраховували. Відсоток радіоактивного марлю, що вивільняється протягом 30 хв,
визначали за формулою: відсоток вивільнення = {[30 хв зразка супернатанта cpm /
(30 хв зразка суперперервного cpm + 30 хв зразка грануляту cpm)] х 100} - {[0 хв
буферний супернатант cpm / (0 хв супернатант cpm + 0 хв гранули cpm)] х 100}. Для
вивчення випуску LPS з плином часу було технічно важко проводити
центрифугування у час, який існує між різними моментами часу. Для цих
експериментів аналіз модифікований для відділення виділеної ЛПС від
бактеріальних клітин за допомогою фільтрації вакуумного колектора з фільтрами
0,45 або 0,22-, um-пор розміром (порівнювані результати були отримані з кожним
фільтром). Відсоток вихідних LPS виділяють наступним чином: відсоток
вивільнення = (час x min фільтрування зразка cpm / час 0 хв фільтрату зразка в
хвилину) x 100. Подальші дослідження проводилися шляхом заміни барбітально-
ацетатного буфера з 0,1 М трис-буфером (рН 7,2 ) або повного розчину Hanks (HBSS
[pH 7,4]), HBSS, що не містить кальцію та магнію, або HBSS, де не вистачає кальцію,
магнію та бікарбонату (Sigma або Whittaker MA Bioproducts, Walkersville, Md.).
Для аналізу вивільненого LPS Для аналізу вивільненого LPS E. coli CL99-2 та S. typhimurium SL696 вирощували з 10,
10 ui [14C] галактозою та інкубували з лактоферрином або EDTA в аналізі
вивільнення LPS, описаного вище, у HBSS, де не було кальцію та магнію. Методи
Перес-Перес та Блазера були використані для аналізу виділеної LPS за допомогою
SDS-PAGE (38). Коротко кажучи, гранульовані клітини суспендували в 200 мкл зони
солюбілізуючого буфера, а супернатанти ліофілізували та ресуспендували в 100 мкл
солюбілізуючого буфера. Всі зразки обробляли протеїназом K протягом 1 години
при 60 ° С, кип'ятили протягом 10 хв та відновлювалися протеїназом К.
Безперервний SDS-PAGE з використанням системи Лаеммлі виконувався з
укладанням 4,5% і підготовленими 15% розчинними гелями з бісакриламидом або
AcrylAide (FMC BioProducts, Rockland, Maine), перехресні лінкери. Потім гелі були
забарвлені, висушені та авторадіографічні (22).
Вплив бактеріальної сприйнятливості лактоферрина та трансферинону до
рифампіну. E. coli CL99-2 вирощували до щільності 108 КФК / мл у модифікованій
ВМС з 0,03 мМ галактози, а бактеріальний інокулят, що містить 5 х І05 КФК,
додавали до 1 мл бульйону ВМС з або без EDTA, лактоферні або рифампіпіну . Суміш
інкубували при 37 ° С; порції видаляли через 0, 2 і 4 години, а кількість
бактеріальних колоній визначали за допомогою плавки на триптичному соєвому
агарі (Sigma).
Статистичний аналіз.
Дані аналізували за допомогою незалежних та парних тестів Student t,
використовуючи програмний пакет ABSTAT (Андерсон-Белл, Canon City, Colo).
РЕЗУЛЬТАТИ Первинні дослідження проводились з лактоферріном з Sigma. Чистоту лактоферрина
визначали SDS-PAGE з модифікованою плямою срібла, яка відображала одну зону
приблизно 80 000 Да (мал. 1А). Це було підтверджено експериментами з подвійною
імунодифузійною експертизами з комерційним лактоферрином проти людського
організму, трансферином проти людини та людським sIgA, що демонструє смугу
преципітану тільки з антитілами лактоферніну (дані не показані). Нарешті,
імуноблотування з комерційною антисептичною залозою показало, що антитіла
лактоферрину визначили основну смугу 80 000-Da і слабку другу частоту приблизно
65 000 Да; антитіла трансферіну, антитіла sIgA та антитіла лізоциму не були
реактивними (рис. 1В). Було виявлено, що препарати лактоферріну та
аполаттофенринові розчини насичені від 3 до 10%, а розчини апотрансферніну
насичені 0,2%, а насичені розчини лактоферріну насичені на 101-102%. Початкові
дослідження, проведені з 104 КОЕ / мл при рН 6.8 лактоферрином, трансферином та
EDTA показали, що препарати, що не обробляються та обробляються
аполактоофрерином, призводять до значного вивільнення LPS, хоча і менше, ніж у
EDTA (табл. 1). На відміну від цього, насичені лактоферрин, трансферін і "апо"
препарати трансферріну та коровячого сироваткового альбуміну не виділяють LPS.
Паралельні інкубації показали, що лактоферрин-опосередкований вивільнення LPS
не був пов'язаний із відмиранням клітин; 30 хв. Кількість колоній становила 84 +
8%, 94 9%, 91 11% та 103 ± 9% від базового для бурбарбілат-ацетатного буфера,
трансферину, EDTA та лактоферрина відповідно (середнє значення ± середнє
значення середнього ступеню швидкості [SEM]). Були проведені дослідження, щоб
визначити оптимальні умови для вивільнення LPS, опосередкованого
лактоферрином. Дослідження, проведені з рН 5,5 до 8,0, показали, що 2 × 10-5 М
EDTA викликали подібний випуск радіоактивної мітки при всіх значеннях рН та
лактоферніну для значень рН від 6,0 до 8,0, хоча при рН 8,0 бактеріальна мембрана
виявилася внутрішньо.
Лактоферрин. Бактерии. - фото pic_d8dc6661c7559c5_1920x9000_1.png
Мал.1. (A) SDS-PAGE купленого молочного лактоферрина. У кожній смузі по 1 пг
різних порцій молочного лактоферрина, а розділювальний гель містить 10%
поліакриламіду. Гель був забарвлений сріблом методом Оуклі (13). (В) Імуноблот
козячого та кроликового антисептику проти купленого молочного лактоферніну.
Смуги: 1, кроликовий проти людського лактоферріну; 2, козячі антитіла
трансферіну; 3, козячий проти людського лізоциму; і 4, козячий проти людського
sIgA. Сироватка лактоферріну проти людської була розбавлена у співвідношенні 1:
500; інші сироватки розбавляли як 1: 100. Пероксидаз хріну, кон'юговану білком A
Aureus Staphy-lococcus, використовували при розведенні 1: 2000. Молекулярні
розміри (в далтонах) позначені ліворуч від панелі А. нестійкі (рис.2). При рН 7,0, як
лактоферрин, так і EDTA викликали порівнянний викид LPS для концентрації
бактерій від 104 до 107 КОЕ / мл, причому фракція LPS виділяється різною, але
фіксується для кожного (рис.3). Збільшення концентрації лактоферіну викликало
збільшення вивільнення 3 Г у діапазоні від 0,05 до 2 мг / мл, наближаючись до межі
від 16 до 18% 3H вивільнення (рис.4). Визначали вивільнення LPS з плином часу, і
виявлено, що як лактоферрин, так і EDTA викликають значний викид протягом 5 хв;
Тривале вивільнення відбувалося через 30 хв (рис. 5). Оскільки ці дослідження були
проведені з мутантом E. coli, що не має епімеразної мутації з UDP-галактозою, то
додаткові дослідження про вивільнення LPS були проведені з двома гладкими
штамів S. typhimurium з диким типом, SL696 та SH4247, які також включають
великий відсоток екзогенна галактоза в LPS .
ТАБЛИЦЯ 1
Звільнення 3H від E. coli CL99-2 при експозиції апо і насиченого лактоферріну
Prepn% 3H виділяється (середнє ± SEM від 4 до 9 екс) бульб-ацетат барбіта .......
.................. 2.0 +1.3 26.0 ± 3.9а "b EDTA, 0.001 М. Лактоферні, 2 мг (2 х 10-5 М) .....
................... Аполактоферрін, 2 мг ....... .................. 5,9 ± 1,7 "b Насичений лактофернін, 2 мг
......................... Апотрансферрин, 2 мг. Трансферрін, 2 мг ....................... Апо-
бовінеземулабуміну, 2 мг. P <0,005 проти барбітально-ацетатного буфера. b P <0,01
проти насиченого лактоферніну. 'Отримано від Sigma. d P <0,05 проти барбітально-
ацетатного буфера.
(23). Лактоферрин та EDTA,, але не трансферрин, вивільняли LPS з обох штамів,
хоча кількість виділених LPS відрізнялася для двох ізолятів (рис.6). У додаткових
дослідженнях ми досліджували вплив різних буферних систем на мембранні ефекти
лактоферрина та трансферину (табл. 2). Результати в трис-буфері були
порівнянними з результатами в барбітал-ацетаті. Проте в дослідженнях з Tris буфер
виявив, що випускає великі кількості LPS самостійно і обмежує відтворюваність
аналізу. При повному HBSS виділення LPS не спостерігалося з EDTA або з будь-яким
із залізо-зв'язуючих білків. На відміну від цього, лактоферрин та EDTA, індукують
вивільнення LPS як у HBSS, де не вистачає кальцію та магнію, а в HBSS, де не існує
калію, магнію та бікарбонату; значно більший викид спостерігався в HBSS, що
містить бікарбонат. У цих дослідженнях виявлене обмежене вивільнення LPS з
штамів E. coli також спостерігалось при експозиції трансферину в HBSS, де не було
кальцію та магнію, хоча вивільнення було менше, ніж спостерігалося при
лактоферні. Дослідження виділення LPS в HBSS, де не було кальцію та магнію,
повторили, використовуючи лактоферрин, отриманий від другого постачальника
(Calbiochem). Друга підготовка лактоферрина також викликала вивільнення LPS з
усіх трьох бактеріальних видів (табл. 3).
Попередня робота з вивченням EDTA-опосередкованого вивільнення LPS показала,
що і хелатор вивільняє фіксовану фракцію LPS, і що збережені та вивільнені фракції
LPS однаково неоднорідні у довжині ланцюга О-полісахаридів (23, 26). Якщо
припустити, що механізм лактоферріну можна порівняти з ЕДТА, він повинен також
вивільнити гетерогенну популяцію молекул ЛПС. Ця гіпотеза була підтверджена
аналізом складу LPS, вивільненого з E. coli CL99-2 та S. typhimurium SL696, за
допомогою SDS-PAGE. З обома штами, лактоферрин та ЕДТА викликали ідентичне
вивільнення гетерогенних популяцій LPS (рис.7). Щоб визначити, чи
опосередкований лактоферрином релакс LPS асоціюється з зміною проникності
зовнішньої мембрани, ми перевірили дію EDTA, лактоферрина та трансферину на
чутливість E. coli CL99-2 до антибіотика рифампіпіну, що зазвичай виключає
зовнішня мембрана. ЕДТА, лактофернін та трансферрин були всі
бактеріостатичними самі по собі, і кожен з них мав більш ніж аддитивний ефект при
збільшенні бактеріальних вбивств через суінгібітурні концентрації рифампіпіну.
Активність лактоферрина майже повністю усувалася насиченням заліза білка (табл.4)
ОБГОВОРЕННЯ
Грам-негативні бацили мають зовнішню мембрану, що складається з асиметричного
ліпідного бішару, причому великі молекули LPS обмежені зовнішньою брошурою
(26, 34). Молекули LPS є аніонними і, як видається, стабілізуються в мембрані
пов'язаними катіонами, включаючи кальцій, магній та залізо (16). Зв'язавши
катіони, що стабілізують мембрану, EDTA виділяє LPS у зовнішній мембрані (26).
Одночасно з вивільненням LPS зовнішній меменбрейн стає більш проникним до
агентам, таким як риампін, які, як правило, виключаються внаслідок гідрофобності.
Дані дослідження показують, що при фізіологічному рівні та концентрації
лактоферрин вивільняє LPS з ентеральних грамнегативних бактерій. При
приблизно еквімолярних концентраціях лактоферрина та EDTA, відповідні кількості
LPS, що вивільняються, порівнянні, і час розкладання LPS аналогічний. Фракція LPS,
що виділяється кожною сполукою, виявляється фіксованою для концентрації
бактерій від 104 до 107 КОЕ / мл. Як лактоферрин, так і EDTA вивільняють
гетерогенні популяції молекул LPS. Звільнення LPS лактоферріном гальмується
насиченням заліза білка, спостереження, яке узгоджується з гіпотезою, що ефекти
мембран залежать від хелатирующей активності, а також від попередніх
спостережень за бактеріостатичними та бактерицидними властивостями білка (2-5,
7, 10, 21, 35, 42, 46, 48)
ПІДТВЕРДЖЕННЯ
Дане дослідження було підтримано Службою досліджень управління ветеранами.
 
Вплив рифампіну, EDTA, лактоферрина та трансферину на ріст E. coli CL99-2 (шість
експериментів)
Лактоферрин та EDTA викликали вивільнення LPS в трьох різних буферних системах
з низькою концентрацією кальцію та магнію, але їх активність була заблокована
високими концентраціями кальцію та магнію, виявленими в HBSS (0,00125 M та
0,001 М, відповідно). Активність лактоферину підвищувалась, коли був присутній
бікарбонат, що дозволяє зробити це як супутній аніон для хелатування іонів металів.
Це узгоджується з відомими хелатними властивостями білків, що зв'язують метал
(57). Саме екзогенні іони кальцію та магнію блокують активність лактоферрина і
трансферин показують, що здатність білків хелатировать ці іони може бути
важливою для спостережуваних ефектів. Проте недавня робота показала, що
лактоферрин може утворювати тетрамери у присутності високих концентрацій
кальцію (6). Це може обмежити біологічну активність білка і буде альтернативним
поясненням для кальцію, блокуючи дію цього білка. Той факт, що концентрації
кальцію та магнію в повному вивільненні LPS-блоку LBS за допомогою
лактоферрина явно можуть обмежувати фізіологічну значимість спостережень. Щоб
визначити важливість цих досліджень, необхідно буде додатково визначити вплив
цих двох катіонів на здатність лактоферрина виділяти LPS. Хоча трансферрин
змінює сприйнятливість до рифампіну, він не виділяв LPS у всіх буферних системах,
а також не випускав такий великий відсоток LPS, як і лактоферрин. Це свідчить про
те, що відмінності в хелатоутворювальній здатності є важливими для вивільнення
LPS або що додатковий механізм сприяє дії лактоферрина. Хоча ми не знаємо про
відносні дослідження про здатність обох білків хелатировать кальцій і магній, ці два
білки відрізняються своєю здатністю хелатировать залізо; лактоферрін - сильніше
хелатора (1, 53). Крім того, трансферин є аніонічним при фізіологічному рівні рН (пл
- 5,5), тоді як лактоферрин дуже катіонний (пл - 8,5) (32, 60). Оскільки це катіон,
лактоферрин може розділяти другий механізм дії з сімейством полікатіологічних
агентів. Ці сполуки включають полілізин, протамин, антимікробні агенти -
поліміксин В і нонапептид поліміксину В (PMBN), а також декілька катіонних білків,
виділених з нейтрофілів (55, 56, 58). Як спосіб, подібний до EDTA, полікатионні
сполуки збільшують проникність зовнішньої мембрани до гідрофобних агентов,
хоча сполуки мають гетерогенні властивості та механізм дії, які неможливо
зрозуміти. Поліміксин B та PMBN викликають як зміну проникності, так і виділення
LPS, тоді як нейтробіологічний бактерицидний ефект / проникність, що збільшує
білок, підвищує проникність мембрани, але не виділяє LPS. Дія цих полікатіонних
сполук може бути результатом здатності вставляти в зовнішню мембрану бактерії
шляхом зв'язування з аніонними молекулами LPS. Відмінності в зв'язуванні або
вставленні мембрани можуть потім пояснити спостережувану мінливість ефектів
(56). Оскільки в декількох дослідженнях було показано, що лактоферрин може бути
пов'язаний з бактеріальною клітинною мембраною, то доцільно заявляти, що
лактоферрин також може розділяти механізм дії з полікатіонними сполуками (3, 40).
Демонстрація більш-ніжної аддитивної взаємодії між білками, що зв'язують залізо і
рифампіпін, відповідає білкам, що змінюють проникність зовнішньої мембрани, хоча
інші пояснення до ефекту не виключаються. Також, мінливість між лактоферріном і
трансфемном по відношенню до впливу на вивільнення LPS та проникності
мембрани не відрізняється від мінливості, зазначеної в полікатіонних сполуках (56).
Більш докладні дослідження будуть необхідні для уточнення точних механізмів
ушкодження зовнішнього мембрани. Якщо ці ефекти можна продемонструвати при
концентраціях кальцію та магнію, які існують in vivo, здатність лактоферіну та
трансферину змінювати структуру зовнішніх мембран грамнегативних бактерій
може покращити їх здатність позбавити бактерії заліза.Це може сприяти їх
бактеріостатичному (і, у разі лактофемно, можливо, бактерицидному) діяльності.
Можливо, що більш важливо, мембранний ефект залізо-зв'язуючих білків може
дозволити їм посилити інші антимікробні системи. Попередня робота з EDTA та
полікатіогенним агентом PMBN показала, що сполуки можуть посилювати
бактерицидний ефект антибіотиків, системи комплементу та лізоциму (11, 26, 34, 43,
44, 50). У 1974 році Лейв висловив припущення, що за винятком його токсичності
EDTA може мати важливу роль як ад'ювант антибіотика (26). Дана робота
передбачає, що лактофернін і трансферрин можуть мати порівняльні ефекти.
Лактоферрин-опосередкована зміна структури зовнішньої мембрани могла б
прояснити спостережувані аддитивні ефекти лактофемну та sIgA (9, 39, 45-47).
Більше того, існують обмежені дані, що свідчать про те, що лізоцим та лактоферні
можуть мати синергічну активність (9). Така взаємодія буде релевантною
фізіологічно, оскільки білки знаходяться в їх найвищих концентраціях на тих самих
ділянках in vivo. Разом вони можуть функціонувати як потужна бактерицидна
система проти грамнегативних бактерій, які лише мінімально впливають на білок.
 
 
 
 
 
Література
LITERATURE CITED
1. Aisen, P., and A. Leibman. 1972. Lactoferrin and transferrin: a comparative
study. Biochim. Biophys. Acta 257:314-323.
2. Arnold,R.R.,M.Brewer,andJ.J.Gauthier.1980.Bactericidal activity of human
lactoferrin: sensitivity of a variety of micro- organisms. Infect. Immun.
28:893-898.
3. Arnold, R. R., M. F. Cole, and J. R. McGhee. 1977. A bacteri- cidal role for
human lactoferrin. Science 197:263-265.
4. Arnold, R. R., J. E. Russell, W. J. Champion, and J. J. Gauthier. 1981.
Bactericidal activity of human lactoferrin: influ- ence of physical conditions
and metabolic state of the target
microorganism. Infect. Immun. 32:655-660.5. Arnold, R. R., J. E. Russell, W.
J. Champion, M. Brewer, and
J. J. Gauthier. 1982. Bactericidal activity of human lactoferrin:
differentiation from the stasis of iron deprivation. Infect. Im- mun. 35:792-
797.
6. Bennett, R. M., G. C. Bagby, and J. Davis. 1981. Calcium- dependent
polymerization of lactoferrin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 101:88-95.
7. Bishop, J. G., F. L. Schanbacher, L. C. Ferguson, and K. L. Smith. 1976.
In vitro growth inhibition of mastitis-causing coliform bacteria by bovine
apo-lactoferrin and reversal of inhibition by citrate and high
concentrations of apo-lactoferrin. Infect. Immun. 14:911-918.
8. Blaser, M. J., J. A. Hopkins, R. M. Berka, M. L. Vasil, and W.-L. Wang.
1983. Identification and characterization of Cam- pylobacterjejuni outer
membrane proteins. Infect. Immun. 42: 276-284.
9. Boesman-Finkelstein, M., and R. A. Finkelstein. 1985. Antimi- crobial
effects of human milk. FEMS Microbiol. Lett. 27:167- 174.
10. Bortner, C. A., R. D. Miller, and R. R. Arnold. 1986. Bacteri- cidal effect
of lactoferrin on Legionella pneumophila. Infect. Immun. 51:373-377.
11. Bryan, C. S. 1974. Sensitization of E. coli to the serum bacte- ricidal
system and to lysozyme by ethyleneglycoltetraacetic acid. Proc. Soc. Exp.
Biol. Med. 145:1431-1433.
12. Bullen, J. J. 1981. The significance of iron in infection. Rev. Infect.
Dis. 3:1127-1138.
13. Bullen, J. J., and H. J. Rogers. 1969. Bacterial iron metabolism and
immunity to Pasteurella septica and Escherichia coli. Nature (London)
224:380-382.
14. Bullen,J.J.,H.J.Rogers,andE.Griffiths.1978.Roleofironin bacterial infection.
Curr. Top. Microbiol. Immunol. 80:1-35.
15. Bullen, J. J., H. J. Rogers, and L. Leigh. 1972. Iron-binding proteins
in milk and resistance to Escherichia coli infection in infants. Br. Med. J.
1:69-75.
16. Coughlin, R. T., S. Tonsager, and E. J. McGroaty. 1983. Quantitation of
metal cations bound to membranes and ex- tracted lipopolysaccharide
ofEscherichia coli. Biochemistry 22: 2002-2007.
17. Finkelstein, R. A., C. V. Sciortino, and M. A. McIntosh. 1983. Role of
Iron in microbe-host interactions. Rev. Infect. Dis. 5: S759-S777.
18. Goldman, R. C., K. Joiner, and L. Leive. 1984. Serum-resistant mutants
of Escherichia coli 0111 contain increased lipopolysac- charide, lack an 0
antigen-containing capsule, and cover more of their lipid A core with 0
antigen. J. Bacteriol. 159:877-882.
19. Goldman,R.C.,andL.Leive.1980.Heterogeneityofantigenic- side-chain length
in lipopolysaccharide from Escherichia coli 0111 and Salmonella
typhimurium LT2. Eur. J. Biochem. 107: 145-153.
20. Griffiths, E. 1975. Effect of pH and haem compounds on the killing of
Pasteurella septica by specific antiserum. J. Gen. Microbiol. 88:345-354.
21. Griffiths, E., and J. Humphreys. 1977. Bacteriostatic effect of human milk
and bovine colostrum on Escherichia coli: impor- tance of bicarbonate.
Infect. Immun. 15:396-401.
22. Hitchcock, P. J. 1983. Aberrant migration of lipopolysaccharide in
sodium dodecyl sulfate/polyacrylamide gel electrophoresis. Eur. J. Biochem.
133:685-688.
23. Hukari, R., I. M. Helander, and M. Vaara. 1986. Chain length
heterogeneity of lipopolysaccharide released from Salmonella typhimurium
by ethylenediaminetetraacetic acid or polycations. Eur. J. Biochem.
154:673-676.
24. Joiner, K. A., R. Goldman, M. Schmetz, M. Berger, C. H. Hammer, M.
M. Frank, and L. Leive. 1984. A quantitative analysis of C3 binding to 0-
antigen capsule lipopolysaccharide and outer membrane protein of E. coli
0111B4. J. Immunol. 132:369-375.
25. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly
of the head of bacteriophage T4. Nature (London) 227:680-685.
26. Leive, L. 1974. The barrier function of the gram-negative
envelope. Ann. N.Y. Acad. Sci. 235:109-127.27. Makelfi, P. H., M. Sarvas,
S. Calcagno, and K. Lounatmaa.
1978. Isolation and genetic characterization of polymyxin-resistant
mutants of Salmonella. FEMS Microbiol. Lett. 3:323-326. 28. Masson, P.
L., J. F. Heremans, and C. Dive. 1966. An iron- binding protein common to
many external secretions. Clin.
Chim. Acta 13:735-739.29. Masson, P. L., J. F. Heremans, J. J. Prignot, and
G. Wauters.
1966. Immunohistochemical localization and bacteriostatic properties of an
iron-binding protein from bronchial mucus. Thorax 21:538-544.
30. Masson, P. L., J. F. Heremans, and E. Schonne. 1969. Lacto- ferrin, an
iron-binding protein ni [sic] neutrophilic leukocytes. J. Exp. Med.
130:643-658.
31. Mazurier, J., and G. Spik. 1980. Comparative study of the iron-binding
properties of human transferrins. I. Complete and sequential iron saturation
and desaturation of the lactotransfer- rin. Biochim. Biophys. Acta 629:399-
408.
32. Moguilevsky, N., L. A. Retegui, and P. L. Masson. 1985. Comparison of
human lactoferrins from milk and neutrophilic leucocytes. Biochem. J.
229:353-359.
33. Mokrasch, L. C., and R. W. McGilvery. 1956. Purification and
properties of fructose-16-di-phosphatase. J. Biol. Chem. 221: 909-927.
34. Nikaido, H., and M. Vaara. 1985. Molecular basis of bacterial outer
membrane permeability. Microbiol. Rev. 49:1-32.
35. Nonnecke, B. J., and L. K. Smith. 1984. Inhibition of mastitic bacteria
by bovine milk apo-lactoferrin evaluated by in vitro microassay of
bacterial growth. J. Dairy Sci. 67:606-613.
36. Norrod,P.,andR.P.Williams.1978.Effectsofironandculture filtrates on
killing of Neisseria gonorrhoeae by normal human serum. Infect. Immun.
21:918-924.
37. Oakley, B. R., D. R. Kirsch, and N. R. Morris. 1980. A simplified
ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gels.
Anal. Biochem. 105:361-363.
38. Perez-Perez, G. I., and M. J. Blaser. 1985. Lipopolysaccharide
characteristics of pathogenic campylobacters. Infect. Immun. 47:353-359.
39. Rainard, P. 1986. Bacteriostasis of Escherichia coli by bovine
lactoferrin, transferrin and immunoglobulins (IgGl, IgG2, IgM) acting alone
or in combination. Vet. Microbiol. 11:103-115. Redhead, K., T. Hill, and H.
Chart. 1987. Interaction of lacto- ferrin and transferrins with the outer
membrane of Bordetella pertussis. J. Gen. Microbiol. 133:891-898.
40.
41. 42.
43. 44.
45. 46.
47.
48. 49.
Reiter, B. 1983. The biological significance of lactoferrin. Int. J. Tiss.
Reac. 5:87-96.Reiter, B., J. H. Brock, and E. D. Steel. 1975. Inhibition of
Escherichia coli by bovine colostrum and post-colostral milk. II. The
bacteriostatic effect of lactoferrin on a serum-susceptible and serumresistant
strain of E. coli. Immunology 28:83-95. Repaske, R. 1956. Lysis
ofgram-negative bacteria by lysozyme. Biochim. Biophys. Acta 22:189-191.
Reynolds, B. L., and H. Pruul. 1971. Sensitization of comple- mentresistant
smooth gram-negative bacterial strains. Infect. Immun. 3:365-
372.Rogers, H. J., and C. Synge. 1978. Bacteriostatic effect of human milk
on Escherichia coli: the role of IgA. Immunology 34:19-28.
Spik, G., A. Cheron, J. Montreuil, and J. M. Dolby. 1978. Bacteriostasis
of a milk-sensitive strain of Escherichia coli by immunoglobulins and ironbinding
proteins in association. Im- munology 35:663-671.
Stephens, S., J. M. Dolby, J. Montreuil, and G. Spik. 1980. Differences in
inhibition of the growth of commensal and enteropathogenic strains of
Escherichia coli by lactotransferrin and secretory immunoglobulin A
isolated from human milk. Immunology 41:597-603.
Stuart, J., S. Norrell, and J. P. Harrington. 1984. Kinetic effect of human
lactoferrin on the growth of Escherichia coli 0111. Int. J. Biochem.
16:1043-1047.Tabak, L., I. D. Mandel, M. Herrera, and H. Baurmash. 1978.
Changes in lactoferrin and other proteins in a case of chronic recurrent
parotitis. J. Oral Pathol. 7:91-99.
50. Tamaki, S., and M. Matsuhashi. 1975. Increase in sensitivity to antibiotics
and lysozyme on deletion of lipopolysaccharides in Escherichia coli strains.
J. Bacteriol. 114:453-454.
51. Tenovuo, J., O.-P. J. Lehtonen, A. S. Aaltonen, P. Vilja, and P. Tuohimaa.
1986. Antimicrobial factors in whole saliva of human infants. Infect. Immun.
51:49-53.
52. Tesh, V. L., R. L. Duncan, Jr., and D. C. Morrison. 1986. The
interaction of Escherichia coli with normal human serum: the kinetics of
serum-mediated lipopolysaccharide release and its dissociation from
bacterial killing. J. Immunol. 137:1329-1335.
53. Teuwissen, B., P. L. Masson, P. Osinski, and J. F. Heremans. 1972. Metalcombining
properties of human lactoferrin. The possible involvement of
tyrosyl residues in the binding sites. Spectrophotometric titration. Eur. J.
Biochem. 31:239-245.
54. Towbin, H., T. Staehelin, and J. Gordon. 1979. Electrophoretic transfer
of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and
some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354.
55. Vaara, M., and T. Vaara. 1983. Polycations as outer membrane- disorganizing agents. Antimicrob. Agents Chemother. 24:114- 122.
56Vaara, M., and P. ViUanen. 1985. Binding of polymyxin B nonapeptide to
gram-negative bacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 27:548-554.Van
Snick, J. L., P. L. Masson, and J. F. Heremans. 1973. The involvement of
bicarbonate in the binding of iron by transferrin. Biochim. Biophys. Acta
322:231-233.
57Weiss, J., K. Muello, M. Victor, and P. Elsbach. 1984. The role of
lipopolysaccharides in the action of the bactericidal/perme- ability
increasing neutrophil protein on the bacterial envelope. J. Immunol.
132:3109-3115.
West, S. E. H., and P. F. Sparling. 1985. Response of Neisseria gonorrhoeae
to iron limitation: alterations in expression of membrane proteins without
apparent siderophore production. Infect. Immun. 47:388-394.
60White, A., P. Handler, E. L. Smith, R. L. Hill, and I. R. Lehman. 1978.
Principles of biochemistry, 6th ed., p. 906. McGraw-Hill Book Co., New
York.Wilkinson, R. G., P. Gemski, Jr., and B. A. D. Stocker. 1972. Nonsmooth
mutants of Salmonella typhimurium: differentia- tion by phage
sensitivity and genetic mapping. J. Gen. Micro- biol. 70:527-554.
 
Источник: http://ua-pharm.com/for-doctors/bakterialnye-i-virusnye-infekcii/
Комментарии
Пока нет комментариев
Витрина
Контакты
Vipmama
Телефоны:
+380 (63) 646-98-04показать+380 (63) 646-98-04 все+380 (63) 646-98-04 +380 (67) 525-77-41
Адрес:
Украина, Киев, Киев на карте
Включен режим редактирования. Выйти из режима редактирования
наверх